Німецький мікробіолог Роберт Кох вперше спостерігав колонії невидимих оку істот – туберкульозних бацил. Тепер, приблизно через століття, російські біологи досліджують вже не колонії бактерій, а колонії окремих молекул – інформаційні макромолекули спадковості – ДНК і РНК. І не тільки досліджують, але і навчилися розмножувати їх в особливій середовищі, що рано чи пізно допоможе збереженню і множенню здоров'я багатьох і багатьох мільйонів людей.

Палички Коха

Роберт Кох у школі був першим учнем, мріяв стати морським лікарем і об'їздити весь світ. Вступивши до Геттінгенського університету, він спочатку навчався на природничому факультеті, але бідно жили батьки вмовили сина перейти на «хлібний» медичний факультет. Вони з нетерпінням чекали, коли він стане лікарем і почне добре заробляти.

На жаль, навіть з дипломом доктора знайти «хлібне» місце виявилося непросто. У 1872 році Кох стає санітарним лікарем («Фізікус») в містечку Вольштейн (нині це Польща). Його робота зводилася до видачі свідоцтв про хворобу, він встановлював розвиток епідемій, робив щеплення, розкривав трупи.

Але, незважаючи на зайнятість, Роберт Кох створює домашню лабораторію і починає займатися науковою роботою.

Замість газу для підігріву препаратів він використовував гасову лампу. З тарілок, наповнених мокрим піском, спорудив щось на зразок приладу для розведення мікробів. На цей пісок він капав кров зараженої тварини і спостерігав за зростанням бактеріальної культури. Стежив за допомогою мікроскопа, який він за рахунок найсуворішої економії коштів купив собі до дня народження – на двадцатівосьмілетіе. З цим скромним інструментарієм «батько бактеріології» зробив ряд відкриттів, які вразили буквально весь світ.

Вінцем наукової кар'єри вченого слід вважати розгадку таємниць туберкульозу. У ті часи вважалося, що від цієї хвороби гине сьома частина людства. Нині вважають, що мікобактеріями туберкульозу інфікована приблизно третину населення Землі.

У XIX столітті туберкульоз звали «бугорчатка». У заражених цією хворобою людей і тварин знаходили в ураженому органі горбки. Вони складалися з розпаду живої тканини, гною. У них-то, мабуть, і сиділи мікроби, виявити які ніяк не вдавалося. За цю справу взявся Кох, який отримав до того часу вже чималу популярність, перебрався до Берліна, де в нього була власна добре обладнана лабораторія, з якої він не виходив з ранку до пізньої ночі.

Вирізав шматочки заражених органів померлих від туберкульозу людей і ретельно їх досліджував.

Знадобилися роки наполегливої праці, щоб наочно показати світу мікроби бугорчатки. Це не були товсті, великі, хоОшо видимі палички до того вивченою Кохом сибірської виразки. Це були ледь помітні навіть під хорошим мікроскопом тонесенькі рисочки, які охрестили «паличками Коха».

24 березня 1882 Роберт Кох робить у Берлінському фізіологічному суспільстві обезсмертив його доповідь «Про етіології туберкульозу». Його виступ мав величезний резонанс. Мабуть, важко знайти в історії медицини інше повідомлення, так само гаряче прийняте усією світовою громадськістю. І не дивно, що в 1905 році саме ці дослідження Коха були відзначені Нобелівською премією.

Революція в бактеріології

Щоб дослідити істоти-невидимки (мікроби), необхідно зуміти розгледіти їх.

Також треба домогтися, щоб це була потрібна бактерія, а не випадково трапилася під руку.

До Коха бактерій розводили в рідких поживних середовищах, головним чином у бульйоні. Зрозуміло, що, коли їх поміщали в ці рідкі середовища, не було гарантії, що тут же поруч не виростуть і сторонні мікроби. Доводилося – і не раз! – Повторювати і повторювати одні й ті ж операції, щоб дістатися до потрібних бактерій. З того місця, де вони концентрувалися найбільше, брали маленьку крапельку, переносили її в іншу пробірку з бульйоном і там вирощували цю колонію.

На жаль, виявлялося, що і тут були присутні сторонні мікроби, хоча і в меншій кількості. Знову брали крапельку досліджуваних мікроорганізмів, переносили в третю пробірку – і так до тих пір, поки нарешті не виходила більш-менш чиста культура, вільна від сторонніх включень.

Одного разу Кох випадково помітив, що зварений картопля, розрізаний навпіл, після довгого лежання на лабораторному столі покрився різнокольоровими крапками: зеленими, коричневими, червоними. Вчений зацікавився побаченим. Зняв платинової голкою маленькі шматочки з цих різнокольорових точок і став розглядати під мікроскопом. Виявилося, що кожна точка була колонією бактерій, що розрослася на поверхні картоплі. Різних бактерій! Кох миттєво зрозумів, яке найбільше відкриття зробив. Він знайшов тверду живильне середовище!

Введення Кохом твердих поживних середовищ було революцією в бактеріологічній техніці. У 1881 році він публікує роботу «Методи вивчення патогенних організмів», в якій описує способи вирощування мікробів на твердих поживних середовищах. З їх допомогою вченому вдалося, використовуючи відповідні барвники (фуксин, анілінові фарби), виявити в розтертої туберкульозної тканини хворого крихітні, злегка зігнуті, яскраво-сині забарвлені палички, відомі тепер як палички Коха.

Запропонована Робертом Кохом тверда живильне середовище дя розведення бактерій здійснила справжню революцію в мікробіології. Тепер мікробіологи використовують широкий асортимент твердих поживних середовищ для роботи з різними бактеріальними культурами. На фото зліва: живильне середовище для виділення і розмноження бактерії Е. соlі та інших ентеробактерій. Цей бузковий гель містить вісім компонентів. На фото праворуч: шоколадний агар призначений для виділення та культивування вибагливих мікроорганізмів, що належать до пологів Neisseria, Haemophilus і Streptococcus (S. pneumoniae).

Бактеріальні (а також вірусні) колонії вирощують тепер не тільки в рідкій, але і на твердому живильному середовищі, приготованої на агарі або желатині. Кожна колонія є потомство єдиною бактеріальної клітини, локалізуються в тому місці, де ця батьківська клітка була «посіяна». Метод Коха дозволяє ідентифікувати збудника інфекції за виглядом і властивостями утворених колоній, а також дає можливість прямо підраховувати їх число. Все це робить мікробіологічний аналіз простіше, швидше і дешевше, а результат точніше. При достатньому розведенні посівного матеріалу колонії виявляються просторово розділеними. І окремі клітини не заважають один одному розмножуватися. Тому вдається визначати потрібну бактерію навіть при дослідженні складних сумішей мікроорганізмів, в яких шуканий інфекційний агент присутній у невеликій кількості або є неконкурентоспроможним по відношенню до інших швидкозростаючим видів мікробів.
Метод молекулярних колоній

Роберт Кох показав приклад, гідний усіляких наслідувань. Цим шляхом в кінці вже ХХ століття пішли і російські (тоді радянські) вчені, співробітники Інституту білка Російської академії наук (ІБ РАН) у місті Пущине на Оці, розташованому приблизно в ста кілометрах від Москви.

У 1985 році в ІБ РАН була створена наукова група, перетворена в 1998 році в лабораторію біохімії вірусних РНК, під керівництвом Олександра Четверіна – нині доктора біологічних наук, члена-кореспондента РАН.

Метою створення групи Четверіна була розробка методів ефективного позаклітинного розмноження молекул РНК. Розмноження (клонування) молекул РНК і ДНК буває необхідно при генетичних, імунологічних та інших молекулярно-біологічних дослідженнях; в медицині – для діагностики багатьох хвороб: від вірусних до онкологічних. На довгому шляху до досягнення цієї мети зроблено ряд важливих відкриттів і винаходів. У тому числі був винайдений метод молекулярних колоній (якщо скорочено, ММК).

Особливість цієї наукової новинки в тому, що молекули, що несуть спадкову інформацію, РНК і ДНК, розмножуються не в рідкій, як це зазвичай прийнято, а в особливій середовищі – гелі. Завдяки цьому потомство кожної молекулиутворює колонію, а не поширюється в рідини по всьому об'єму.

Таким чином, окрему молекулу можна розмножити до Детектируемая числа ідентичних молекул, що дає можливість виявити, ідентифікувати і підрахувати поодинокі молекули. Адже кожна колонія є молекулярним клон (безліч копій спочатку поміщеною в дану точку гелю молекули). А число колоній вказує на число молекул ДНК або РНК, що знаходяться в гелі до початку реакції.

Але успіх до Пущинський групи прийшов не відразу. Перешкоди, що стояли на шляху дослідників, були досить серйозними. Порівняємо, наприклад, розміри об'єктів дослідження Коха і групи Четверіна. Бактерії – найчастіше одноклітинні прокаріотні (без'ядерні) мікроорганізми – мають мікронні розміри (1 мікрон = 10-4 сантиметра), в той час як молекули ДНК або РНК – наномолекули (1 нанометр = 10-7 сантиметра), тобто вони на кілька порядків менше бактерій.

Крім того, якщо бактерії і віруси – істоти досить складною, але все ж цілісної, можна навіть сказати, автономної, самодостатньою організації, то ДНК і РНК – лише деталі (хай і важливі) живої клітини, які треба було виділити з клітини (ізолювати) і розмножити. Такі окремі ізольовані макромолекули – субстанції набагато більш уразливі, ніж бактерії.

Розмноження ДНК в клітині

Молекула ДНК самовідтворюється (копіює сама себе) при кожному клітинному поділі. При цьому слабкі зв'язки між двома ланцюгами подвійної спіралі ДНК руйнуються, в результаті чого ланцюжки розділяються. Потім на кожній з них будується другий ланцюг ДНК, комплементарна першою. У результаті при поділі клітини відбувається подвоєння початкової молекули ДНК, так що в обох клітинах виявляється по одній повної копії ДНК. Цей процес називається реплікацією. Так генетична інформація, укладена в ДНК, повністю зберігається при клітинному поділі.

Подібно до того, як організм складається з окремих органів, клітина сконструйована з багатьох частин, відповідальних за харчування, розмноження і виділення всього непотрібного. Численні складові частини, компоненти живої клітини. У ній знаходяться ядро, ядерце, мітохондрії (у тваринних клітинах), хлоропласти (в рослинах), лізосоми, апарат Гольджі, вакуолі, центріолі і так далі. Плюс зовнішні і внутрішні мембрани, що ділять клітину на відособлені відсіки, в яких вона створює свої власні білки, жири, вуглеводи … Ось в якому хитромудрий біоцарстве звично мешкають молекули спадковості ДНК і РНК.

Біологам було потрібно не тільки витягти з клітки ці молекули, але і, головне, створити для них штучне середовище проживання. Яка аналогія тут одразу приходить на думку? Звичайно, що освоює ворожий космос (невагомість, відсутність атмосфери, нульове тиск) осіб. З його скафандрами, орбітальними станціями із запасами їжі, води, всяких систем життєзабезпечення, всього того, що імітує повноцінне життя людини на Землі. Так що Четверін і його співробітники повинні були провести щось на кшталт «космізаціі» молекул ДНК і РНК.

Для розмноження нуклеїнових кислот дослідники з Інституту білка РАН використовували метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Зазвичай ПЛР здійснюють у рідкому середовищі. Співробітники Інституту білка запропонували провести її в спеціально приготовленою пористої гелеобразной масі. Суть методу ПЛР проста: середовище, що містить спіральну молекулу ДНК, нагрівають приблизно до 90 градусів Цельсія, у результаті чого вона розпадається на два ланцюжки. Після невеликого охолодження на кожному ланцюзі за допомогою спеціального ферменту збирають ланцюжок, комплементарную вихідної. У результаті з однієї дволанцюжкової ДНК виходять дві, з двох – чотири і так до нескінченності. Зображення: «Наука і життя».

В якості основної системи розмноження молекул вчені вибрали полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Цей метод широко застосовується в біології та медицині. Але на відміну від традиційної ПЛР, яка проводиться в рідині, дослідники з Інституту білка вирішили здійснювати реакцію в спеціально приготовленою пористої гелеобразной масі.

Тепер – подробиці. Ми вже відзначали, що РНК і ДНК – наномолекули. Виявляється, матрикс (основна речовина) гелю утворює тривимірну мережу з розмірами пор також у нанометровому діапазоні. Ця обставина й дозволяє називати колонії Четверіна колоніями наномолекул, або просто наноколоніямі.

Використання іммобілізованої середовища – ключовий момент: матрикс гелю запобігає конвекцію середовища, перешкоджає дифузії наномолекул.

Тому потомство вихідної молекули концентрується в обмеженій зоні навколо батьківської молекули. Одночасно сама матриксних мережа не робить впливу на дифузію більш дрібних молекул – всього того, що необхідно для розмноження молекул ДНК і РНК, для доставки до них усіх субстратів реакції.

В очікуванні нових тест-систем

Метод молекулярних колоній можна використовувати в багатьох галузях: для надчутливої діагностики вірусів і раку, а також для позаклітинного клонування і скринінгу генів, аж до ідентифікації генів по функції кодованих білків.

Тести, розроблені групою Четверіна, гарантують досить швидкий результат. Виділення нуклеїнових кислот зі зразка крові займає від півгодини до декількох годин, потім ще близько двох годин необхідно для проведення самої реакції.

Співробітники Інституту білка вже використовували свій метод длядіагностики ряду інфекційних захворювань, зокрема на прикладі РНК вірусу СНІДу і ДНК вірусу гепатиту В. Експериментально доведено: чутливість нового методу набагато вище, ніж у старих методів, заснованих на розмноженні РНК або ДНК в рідині.

У лабораторії біохімії вірусних РНК працюють і над діагностикою онкологічних захворювань. Діагностувати рак дослідники хочуть шляхом виявлення в клінічних зразках крові молекул РНК, які наявні у всіх без винятку ракових клітинах. Приклад такого універсального маркера – матрична РНК (мРНК) білка теломерази, ферменту, який відповідає за синтез кінцевих ділянок хромосом (теломер). Ця ж мРНК є і в нормальних стовбурових клітинах, які, подібно раковим, мають здатність до необмеженого поділу. Однак останні перебувають у своїх нішах і не поширюються по організму. Так, присутність теломеразной мРНК там, де стовбурових клітин бути не повинно (наприклад, в плазмі крові), може однозначно вказувати на наявність в організмі злоякісного процесу. Олександр Четверін вважає, що при наявності всіх необхідних контрольних тестів можна буде точно сказати, хвора людина на рак чи ні.

Розроблена методика універсальна і може стати в нагоді не тільки в медицині. Застосування наноколоній може бути вельми корисним і для різних областей біотехнології, сільського господарства, криміналістики, моніторингу навколишнього середовища, фундаментальної науки, нарешті. Це можуть бути хімія одиночних молекул, безклітинні клонування та скринінг генів, секвенування, молекулярна діагностика … Метод молекулярних колоній (ММК), або просто метод наноколоній (МН), з часом неминуче стане розвиненою технологією, яка має унікальні можливостями і високим потенціалом для вирішення наукових і прикладних задач.

За матеріалами: elementy.ru

Tweet

РОЗРОБКА ВЕБ-САЙТІВ, ПРОСУВАННЯ В ІНТЕРНЕТІ